一、引言

       隨著納米技術的飛速發展，納米顆粒在眾多領域展現出巨大的應用潛力，如生物醫藥、材料科學、環境科學等。在這些應用中，精確測定納米顆粒的尺寸、濃度、表面電荷等特性至關重要，因為這些參數直接影響著納米材料的性能、穩定性以及與生物系統的相互作用。傳統的納米顆粒分析技術，如電子顯微鏡（EM）和掃描探針顯微鏡（SPM），雖然能夠提供高分辨率的圖像，但樣品制備復雜、檢測通量低，且通常只能對靜態樣品進行分析，難以滿足對納米顆粒在溶液中動態行為研究的需求。動態光散射（DLS,圖1B）技術作為一種常用的光學集合技術，長期以來被廣泛應用于納米顆粒分散體系的分析，能夠快速、準確地測定顆粒尺寸。然而，DLS 在面對多分散樣品時可靠性下降，其獲得的強度加權平均尺寸（“z 平均"）并不總能準確反映樣品的真實組成。此外，通過經典反卷積算法對相關函數進行分析以提取例如雙峰分布的能力，實際上僅限于僅包含兩種或至多三種尺寸顆粒類型的樣品，且每種顆粒類型的尺寸差異需在實踐中大于 3:1。納米顆粒跟蹤分析技術（NTA,圖1A）的出現為納米顆粒的表征提供了一種全新的解決方案，它能夠實時、逐個地跟蹤和分析納米顆粒在溶液中的布朗運動，從而獲取顆粒的尺寸、濃度等信息，彌補了傳統技術的諸多不足。

圖1，NTA(A)與DLS（B）的原理圖

二、NTA技術原理

       NTA 技術基于激光光散射原理，一束精細聚焦的激光束穿過含有納米顆粒稀懸浮液的樣品池。激光束在液體樣品與光學元件的界面處發生折射，使其路徑接近與玻璃 - 樣品界面平行。位于光束內的顆粒，通過與光束軸垂直對齊的常規光學顯微鏡進行可視化觀察，該顯微鏡收集視野內每個顆粒散射的光。由于 NTA 本質上并非成像技術，系統的總放大倍數相對適中，對于適當稀釋的樣品，顆粒在顯微鏡視野內呈現為在布朗運動下移動的光散射中心。拍攝一段時長通常為20 - 60秒（每秒30幀左右）的運動顆粒視頻，借助專有分析程序逐幀處理。程序自動識別、定位每個顆粒，跟蹤其幀間移動。顆粒識別閾值、相機增益與快門速度等參數可由用戶根據樣品類型調整，以優化圖像。擴散進入散射體積的顆粒被識別并跟蹤，直至其離開光束或靠近相鄰顆粒致跟蹤終止，有效避免因顆粒軌跡交叉導致的錯誤結果。依據布朗運動理論，球形顆粒的擴散系數（Dt）與粒徑遵循斯托克斯 - 愛因斯坦關系：

       其中KB為玻爾茲曼常數，T為絕對溫度，η為粘度，d為流體動力學直徑。顆粒在溶液中的布朗運動速度與其粒徑有關。較小的顆粒由于受到的流體阻力較小，布朗運動速度更快。反之，較大顆粒的布朗運動更慢。通過分析顆粒的布朗運動軌跡，可以計算出顆粒的擴散系數，進而推算出顆粒的粒徑。

三、納米顆粒跟蹤分析技術的優勢

1、多參數同時分析能力

       與傳統的 DLS 技術只能提供強度加權平均尺寸不同，NTA 能夠在跟蹤顆粒布朗運動計算尺寸的同時，測量顆粒散射光的強度，從而生成強度 - 尺寸二維圖。這使得即使對于非單分散的樣品，如不同直徑混合的二氧化鈦納米顆粒，也能通過二維圖更清晰地分辨出各個顆粒群體。此外，NTA 還可通過引入電極施加電場，分析帶電顆粒在電場中的電泳遷移率，實現顆粒尺寸與電泳遷移率的同時測量。以羧化的 150nm 顆粒為例，在施加電場前，可通過分析其布朗運動確定顆粒大小，施加 30V 電場后，顆粒向陽極移動，其電泳軌跡可被可視化并分析，且布朗運動不受電泳運動的影響，能夠同時提取顆粒的尺寸和電泳信息。

2、高分辨率的顆粒尺寸分布測定

       NTA 技術能夠以超越 DLS 的分辨率分辨不同顆粒尺寸，對于多分散體系具有顯著優勢。如對 100nm 和 300nm 聚苯乙烯校準微球的混合物進行分析，能夠清晰地呈現出雙峰分布，并且以顆粒數量為函數展示尺寸分布，可準確獲得每個尺寸類別的顆粒濃度（顆粒數/ml），為復雜樣品中不同尺寸顆粒群體的定量分析提供了有力手段。

3、實時監測顆粒動態變化

       NTA 通過光學顯微鏡成像和顆粒追蹤算法，能夠直觀地觀察到納米顆粒在溶液中的運動軌跡和行為，可實時監測納米顆粒的聚集、分散等動態過程，有助于深入理解納米顆粒的物理化學性質和行為變化。由于 NTA 是對單個顆粒進行實時跟蹤分析，它能夠捕捉到顆粒在溶液中的動態變化過程。例如，在研究病毒顆粒與金屬鹽溶液相互作用時，隨著時間推移，病毒顆粒表面形成金屬涂層，導致其折射率增加，雖然顆粒直徑無顯著變化，但通過 NTA 的二維強度 - 尺寸圖可實時觀察到這一變化，直觀地反映出顆粒性質的動態演變。

四、NTA儀器構成

       典型的NTA儀器主要由激光光源、顯微鏡、樣品池、相機及數據分析軟件組成（圖2）。激光光源提供穩定且聚焦良好的光束；顯微鏡用于觀察顆粒散射光，其光學性能影響顆粒可視化效果；樣品池容積約250µl、深度500µm，帶有Luer接口，方便通過注射器進樣，且能確保樣品在分析前20秒達到熱平衡；相機（CCD或CMOS相機）捕捉顆粒散射光圖像，其靈敏度與幀率對數據采集質量關鍵；數據分析軟件則負責處理視頻數據，實現顆粒追蹤、參數計算與結果呈現。

圖2，NTA的結構示意圖

五、NTA技術在多領域的應用進展

       納米顆粒跟蹤分析儀的用途非常廣泛，在科研系統的研究領域里，可以在脂質體和藥物傳遞納米顆粒、蛋白質聚集物、10-1000nm金屬和無機納米顆粒、高分子納米懸浮液、稀土納米顆粒及量子點/多層碳納米管、疫苗研發、納米氣泡、納米毒理學和生物標記物、細胞外泡(外泌體和微泡)等領域進行粒徑大小測量、濃度測量、熒光純度檢測及Zeta電位測量。因此其在生物醫學、藥物開發、納米材料科學、環境科學、化學工程等領域廣泛使用。

圖3、NTA的應用領域

1、藥物遞送

       通過精確測量顆粒尺寸分布和濃度，研究人員可以更好地優化遞送載體的設計和制備工藝，確保藥物能夠以合適的粒徑和濃度到達目標部位，從而提高藥物的療效和安全性，這也是在藥物研發過程中對這些參數進行測量具有重要意義的原因。

2、材料科學領域

       在納米材料合成與表征中，NTA用于實時監測納米顆粒生長過程，追蹤粒徑、濃度隨時間變化，助力優化合成工藝參數，如制備金納米顆粒時，精確調控粒徑分布。在材料穩定性研究方面，可檢測顆粒團聚、沉降等變化，評估不同環境條件（溫度、pH、離子強度）對材料穩定性影響，為納米材料長期儲存與應用提供依據。

3、病毒學與疫苗生產

       準確計數和測量病毒、噬菌體及其聚集體對于疫苗研發、生產及質量控制至關重要，保障疫苗的質量和穩定性，確保疫苗在預防疾病方面的有效性和安全性。

4、蛋白質聚集物

       在細胞培養、純化、配方、包裝和儲存等多個單元操作過程中都可能發生蛋白質聚集。確定蛋白質聚集的狀態和動力學對于提高產品穩定性和優化生產過程具有重要意義。

5、環境科學領域

       監測環境水樣、大氣顆粒物中的納米顆粒，分析其來源、成分、遷移轉化規律。如研究水中金屬納米顆粒污染，NTA結合其他分析技術，識別顆粒種類、粒徑范圍，評估潛在生態風險，為環境監測與污染治理提供數據支持。

6、納米氣泡

       納米氣泡具有廣泛的應用潛力，包括在藥物遞送、清潔和消毒等方面。NTA技術在納米氣泡研究中發揮著重要作用，它能夠直接在溶液中可視化納米氣泡，并提供關于氣泡尺寸和濃度的信息。

7、外泌體外囊泡

       保證外泌體的原始狀態條件下，對外泌體，外囊泡進行快速實時動態檢測，測量參數包括顆粒粒徑、散射光強、濃度等，可對抽提獲得的外泌體進行粒徑大小及數量進行統計。搭配響應的激光器與濾片，可在復雜背景條件下，使用熒光抗體標記外泌體，可對外泌體進行熒光測量。

六、總結

       納米顆粒跟蹤分析技術（NTA）能實現對單個納米顆粒的實時、同步多參數分析，提供粒徑、濃度、表面電荷等豐富信息，這是傳統方法難以企及的。對于多分散體系，NTA可精準分辨不同粒徑顆粒群體，準確反映樣品真實情況。操作相對簡便，樣品制備要求低，分析速度快，能在短時間內給出結果，大幅提高研究效率。

       NTA憑借其可靠的原理、先進的儀器設計、簡便的操作流程以及優異的性能優勢，在納米材料研究的各個領域展現出強大的應用潛力。通過與傳統納米顆粒分析方法的對比，凸顯了其在多參數分析、高分辨率粒徑測定、實時動態監測等方面的不可替代性。隨著納米科技的持續發展，NTA技術有望在更多領域得到深入應用與拓展，不斷推動納米材料的創新研發、產品質量提升以及納米技術與其他學科的交叉融合，為解決諸多科學與工程難題提供有力的技術保障，開啟納米表征技術的新篇章。

關于納米顆粒跟蹤分析儀LighTracker

      LighTracker是由四度科學儀器精心打造的新一代納米顆粒跟蹤分析儀（NTA），為納米顆粒分析帶來令人驚嘆的高效與精準。僅需幾分鐘，便能全面呈現納米顆粒的粒徑分布信息，涵蓋最小粒徑、最大粒徑，以及各個粒徑區間顆粒的數量占比，為納米顆粒的精細研究提供詳盡數據。不僅如此，LighTracker還具備強大的熒光檢測功能和Zeta電位測量能力，為納米藥物載體的制備、細胞外囊泡的分析提供關鍵支持。LighTracker能夠實時追蹤納米顆粒在不同環境條件下的濃度變化，深入剖析納米顆粒在環境及反應中的擴散、遷移、轉化與降解過程。讓科研工作者能夠直觀地觀察納米顆粒的行為變化，為納米材料的研發、納米藥物的療效評估以及納米環境毒理學研究提供了有力工具。